11月10日，我院羊遗传改良与生物育种团队王小龙教授参与的一项题为 Live birth of chimeric monkey with high contribution from embryonic stem cells 的研究以封面文章在《Cell》在线发表。中国科学院脑科学与智能技术卓越创新中心（神经科学研究所）刘真研究员、中国科学院广州生物医药与健康研究院Miguel A. Esteban研究员、中国科学院脑科学与智能技术卓越创新中心孙强研究员为通讯作者，我院2022级博士生曹静为第一作者，我校为联合署名单位。

胚胎干细胞是指由着床前囊胚的内细胞团在体外分离培养而来的多能性细胞，它被广泛应用于生命科学研究，在包括模型构建、细胞治疗、器官再生、基础研究、类器官模型、生物医药等领域发挥着重要作用。经典的胚胎干细胞具有体外无限自我复制更新、诱导实现多向分化、胚胎注射形成嵌合体等关键特征，其中嵌合体的获得被认为是鉴定胚胎干细胞的金标准。基于小鼠胚胎干细胞囊胚注射嵌合体的基因打靶技术是遗传修饰小鼠模型构建的经典技术，作为遗传修饰动物模型构建的关键技术，1985年首次实现小鼠胚胎干细胞嵌合体，2008年成功实现大鼠胚胎干细胞嵌合体，然而包括非人灵长类在内的其他大动物的胚胎干细胞嵌合体研究一直进展缓慢。

为解决这一难题，联合研究团队首先建立了处于6种不同培养体系下的食蟹猴胚胎干细胞，进而从克隆形态、免疫荧光、转录组、线粒体代谢、全基因组甲基化、核型分析和全基因组测序等多方面对处于不同培养条件下食蟹猴胚胎干细胞进行全面系统的评估。发现5iLAF、4CL和PXGL体系下培养的食蟹猴胚胎干细胞具有较高的多能性，而且4CL体系下的干细胞具有更好的传代稳定性和基因组稳定性。胚胎干细胞注射入受体胚胎后的快速凋亡是影响胚胎干细胞成功嵌合的关键。研究团队选用绿色荧光蛋白标记的4CL条件下的胚胎干细胞进行猴胚胎注射实验，通过测试和优化胚胎干细胞注射入受体胚胎后的不同培养基和培养时间的组合，最终得到了既不影响胚胎正常发育又能保证干细胞存活的最优嵌合胚胎培养条件。而且5iLAF和Primed体系下的胚胎干细胞在该优化条件下也表现出胚胎注射后的高存活率（图1）。将注射了4CL和5iLAF干细胞的嵌合胚胎分别在体外延迟培养到第17天，发现注射的胚胎干细胞仍然可以高效存活，单细胞测序证明猴胚胎干细胞可以与受体胚胎细胞同步发育贡献到第17天猴胚胎的不同细胞谱系中。

在系统评估了不同培养条件下猴胚胎干细胞状态和改进优化了嵌合胚胎培养条件的基础上，研究团队进一步将注射了绿色荧光标记的4CL干细胞的胚胎移植到代孕母猴。在总共得到的10只出生或流产的仔猴中，有一只出生存活猴和一只流产猴检测到胚胎干细胞的嵌合。研究团队建立了包含PCR扩增、微卫星亲子鉴定、基因组SNP深度测序、流式细胞仪检测、绿色荧光蛋白检测、免疫荧光检测的一系列严格的嵌合体分析流程，发现出生存活猴中胚胎干细胞的贡献比例高达70%左右，流产猴中胚胎干细胞的贡献比例约20%。单细胞转录组测序也进一步证明了注射的胚胎干细胞可以跟受体胚胎细胞同步分化到出生个体猴的各种不同细胞谱系。同时研究团队在两只嵌合体猴的胎盘组织和生殖细胞中均发现了胚胎干细胞的高比例贡献，该结果说明灵长类胚胎干细胞可能具有不同于啮齿类的独特的发育全能性特征，这对后续基于该技术的遗传修饰模型构建至关重要。

非人灵长类胚胎干细胞嵌合体研究模式图及封面

该工作全面系统地评估了不同培养条件下猴胚胎干细胞的多能性状态，并通过优化改进嵌合胚胎的培养条件显著提升了胚胎干细胞注入胚胎后的存活效率，最终得到了出生存活的高比例胚胎干细胞来源的嵌合体猴，证明了猴胚胎干细胞可以高效的贡献到包括胎盘和生殖细胞在内的各种不同组织和细胞。该研究对于理解灵长类胚胎干细胞全能性和发育潜能具有重要意义，为建立基于猴胚胎干细胞嵌合体的基因打靶和模型构建技术奠定了基础。

王小龙教授与刘真研究员在大动物胚胎干细胞研究方面保持着长期的学术合作，我校博士生曹静在他们的共同指导下，在各方面受到良好的训练，为这项工作的完成做出了重要贡献。

文章链接：https://www.cell.com/cell/fulltext/S0092-8674(23)01087-5